产品货号：
GS5315
中文名称：
第二链cDNA合成试剂盒
英文名称：
EsyNGS Second-Strand cDNA Synthesis Kit
产品规格：
24T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品应用：
产品组成：
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期1年。
注意事项：
实验准备：
实验流程：
相关搜索：第二链cDNA合成试剂盒，EsyNGS Second-Strand cDNA Synthesis Kit
本制品是以一链合成试剂盒产物为模板进行二链合成修复加A以生成双链cDNA产物。此产物可直接纯化，纯化后进行末端修复建库测试。
产品应用：
本制品适用于已经进行逆转录文库的RNA样本，本制品可对逆转录后的文库直接使用，本制品不包含末端修复加A尾步骤，cDNA合成后使用磁珠纯化，纯化后可使用末修加A试剂盒进行实验。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| Second Strand Buffer(dNTP) | 120μL |
| Second Strand Buffer(dUTP) | 120μL |
| Second Strand Enzyme | 72μL |
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期1年。
注意事项：
- 本制品只适用于已经进行逆转录后的RNA样本，不可直接对RNA样本进行使用。
- 试剂盒中的酶溶液对于温度敏感，请于使用前取出加入即可，使用弹混即可。
- 实验开始前，请清洁操作台，确保没有RNA酶和DNA的污染。
- 进行先关实验前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
实验准备：
- 逆转录RNA文库准备：本试剂盒不包含mRNA富集，rRNA去除以及逆转录试剂盒，实验前先对RNA样本进行逆转录。
- 自备试剂准备：mRNA富集试剂盒、rRNA去除试剂盒、一链合成试剂盒、Nuclease-Free Water。
- 自备仪器及耗材：
仪器/耗材名称 备注 PCR基因扩增仪 / 微型离心机 / 涡旋振荡混匀仪 / 移液器 / 荧光定量仪 用于DNA定量 Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer system 或其它同类产品 磁力架(0.2mL*16孔) / 检测管(适配Qubit平台) / 检测联管(适配Qubit平台) / 0.2mL透明平盖PCR薄壁管 建议选择无核酸酶的产品 0.2mL八连排透明PCR薄壁管 建议选择无核酸酶的产品 1.5mL无色灭菌离心管 建议选择无核酸酶的产品 1000μL 吸头建议选择无核酸酶带滤芯的产品 200μL吸头 建议选择无核酸酶带滤芯的产品 0.5～10μL吸头 建议选择无核酸酶带滤芯的产品
实验流程：
- 试剂及样本准备
- 逆转录文库准备
- 在开始实验前，请先使用一链合成试剂进行RNA逆转录实验。
- 将试剂盒中除酶外各组分置于冰上融化后颠倒混匀，瞬时离心后备用。
- 在开始实验前，请先使用一链合成试剂进行RNA逆转录实验。
- 逆转录文库准备
- 实验步骤
- 取0.2mL PCR管，按照下表配制反应体系，加入各组分，请务必在冰上进行操作。
成分 用量 逆转录文库 30μL 2nd Strand Reaction Buffer(dNTP) 5μL 2nd Strand Reaction Buffer(dUTP) 5μL 2nd Strand Enzyme 2μL Nuclease-Free Water 8μL 根据进行的相关实验，选择合适的Second Strand Buffer进行实验，若需要进行链特异性建库，则选择Second Strand Buffer(dUTP)进行；若不进行链特异性建库，则选择Second Strand Buffer (dNTP)进行即可。 - 按照下表设置PCR程序，无热盖温度。
步骤 温度 时间 1 16℃ 40min 2 4℃ Hold - 将步骤B.1的反应液完全涡旋混匀后，瞬时离心30sec，立即置于PCR仪中，并启动反应程序。将装有反应液的PCR管离心后，请注意不要产生气泡，以免影响PCR反应。
- 合成的cDNA文库的纯化推荐使用分选磁珠，向反应体系中加入1.8×体积(81μL)磁珠进行纯化，具体步骤如下：
- 将磁珠置于室温平衡30min，使用前涡旋或者振荡混匀。
- 合成cDNA文库后，向步骤B.3的产物中加入1.8×体积(81μL)磁珠进行纯化，用移液器吹打或者涡旋混匀30sec。
- 室温孵育5min，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液完全澄清后，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸到磁珠。
- 将PCR管置于磁力架上，加入200μL 80%乙醇(现用现配)，静置30sec(不用吹散磁珠)，弃除上清。
- 重复步骤d一次。
- 将含有磁珠的PCR管从磁力架上取下，瞬时离心10sec，置于磁力架上，用小量程的移液器小心将残留液去除，开盖室温晾干0.5～1min，至管壁无明显水珠即可。干燥至磁珠界面无明显水珠即可，不可过分干燥，以免造成磁珠龟裂。
- 加入27μL Nuclease-Free Water或者0.1×TE Buffer至PCR管内，使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮，室温静置5min，将PCR管放置于磁力架上静置2min，使磁珠完全贴壁后，转移25μL上清至新的PCR管中。
- 样品可置于冰上继续进行末端修复加A文库构建或其他分析应用，也可置于-30℃～-15℃保存。
- 将磁珠置于室温平衡30min，使用前涡旋或者振荡混匀。
- 取0.2mL PCR管，按照下表配制反应体系，加入各组分，请务必在冰上进行操作。
相关搜索：第二链cDNA合成试剂盒，EsyNGS Second-Strand cDNA Synthesis Kit